Jeśli kiedykolwiek patrzyłeś przez mikroskop, aby uchwycić skomplikowane szczegóły komórki, maleńkiego włókna tekstylnego lub elementu mikroelektronicznego, prawdopodobnie miałeś do czynienia z dwoma najpopularniejszymi typami soczewek obiektywowych: obiektywami suchymi i obiektywami glicerynowymi. Jako dostawca obiektywów do mikroskopów, który od ponad dziesięciu lat współpracuje z laboratoriami, instytucjami badawczymi i zespołami przemysłowymi, widziałem na własne oczy, jak wybór odpowiedniego obiektywu może zadecydować o obserwacji lub przerwać obserwację. Przyjrzyjmy się więc kluczowym różnicom, kiedy używać każdego z nich i jak soczewki z naszego katalogu pasują do tych kategorii.
Zacznijmy od podstaw: soczewka obiektywu to główny element optyczny, który zbiera światło z próbki, powiększa je i rzuca w górę, w stronę okularu lub aparatu. Przestrzeń pomiędzy dnem obiektywu a powierzchnią próbki to miejsce, w którym obiektywy suche i obiektywy zanurzone w glicerynie różnią się najbardziej. Obiektywy suche, jak sama nazwa wskazuje, mają powietrze wypełniające szczelinę pomiędzy soczewką a próbką. Z kolei obiektywy do zanurzania w glicerynie wykorzystują ciecz (prawie zawsze glicerol, chociaż w niektórych wariantach wykorzystują inne płyny), aby pokonać tę odległość. Ta pojedyncza różnica wpływa na wydajność, konstrukcję i przypadki użycia w sposób istotny dla każdego użytkownika.
Zagłębmy się w wydajność optyczną, czyli istotę tego, dlaczego wybór luki ma znaczenie. Światło nie przemieszcza się z tą samą prędkością w różnych ośrodkach, a kiedy przechodzi z jednego materiału do drugiego, załamuje się (zgina). Kiedy soczewka suchego obiektywu znajduje się w powietrzu, większość światła padającego na próbkę pochodzi z góry, ale powietrze ma współczynnik załamania światła ~1,0. Szkło obiektywu ma wyższy współczynnik załamania światła (około 1,5), więc światło przechodząc ze szkła do powietrza i próbki załamuje się pod bardziej stromym kątem. Może to prowadzić do utraty apertury numerycznej (NA) – krytycznej metryki mierzącej zdolność obiektywu do wychwytywania światła z próbki i bezpośrednio powiązanej z rozdzielczością. Rozdzielczość, zdefiniowana równaniem Abbego, wynosi w przybliżeniu 0,61 λ/NA, gdzie λ to długość fali użytego światła. Oznacza to, że wyższe NA oznacza wyraźniejsze i bardziej szczegółowe obrazy. Na przykład suchy obiektyw o dużym powiększeniu może osiągnąć wartość NA wynoszącą około 0,95 dla obiektywu 100x, ale jest to maksymalna wartość, jaką można osiągnąć w przypadku powietrza.
Z drugiej strony glicerol ma współczynnik załamania światła ~ 1,47, czyli znacznie bliższy współczynnikowi szkła. Po wypełnieniu szczeliny między soczewką a próbką gliceryną światło ugina się znacznie mniej podczas przemieszczania się między soczewką a płynem, dzięki czemu wychwytuje się więcej światła. Dzięki temu obiektywy zanurzeniowe w glicerynie osiągają wartości NA do 1,6 dla soczewek 100x, a czasami nawet wyższe w przypadku modeli specjalistycznych. Ta dodatkowa NA przekłada się bezpośrednio na rozdzielczość: 100-krotny suchy obiektyw przy NA 0,95 może rozróżnić szczegóły tak małe jak ~200 nanometrów, podczas gdy 100-krotny obiektyw immersyjny z gliceryną przy NA 1,4 może rozdzielczość ~170 nanometrów wystarczy, aby zobaczyć drobne struktury, takie jak pojedyncze mikrotubule w komórkach lub defekty w cienkowarstwowych półprzewodnikach, które sucha soczewka rozmazałaby.
Widać to nie tylko w przypadku obiektywów o dużej mocy. Obiektywy o niższym powiększeniu (takie jak 10x lub 20x) również mogą przynieść korzyści, zwłaszcza w zastosowaniach, w których nawet mała rozdzielczość ma znaczenie, np. w badaniach histopatologicznych lub materiałoznawczych. To powiedziawszy, obiektywy zanurzeniowe w glicerynie nie są uniwersalne, a ich konstrukcja wiąże się z kompromisami, których unikają obiektywy suche.
Następnie porozmawiajmy o projektowaniu i praktycznym zastosowaniu. Obiektywy suche są znacznie prostsze w użyciu, konserwacji i przechowywaniu. Nie trzeba zarządzać płynem, nie ma ryzyka rozlania lub wyschnięcia, a ponadto można zmieniać suche obiektywy bez zmiany sposobu przygotowywania próbek. Nasza oferta suchych obiektywów obejmuje takie opcje, jak obiektyw achromatyczny 185, idealny do rutynowych zadań laboratoryjnych, pasujący do standardowych mikroskopów, a także obiektyw achromatyczny Infinite Plan do zastosowań wymagających płaskich, pozbawionych zniekształceń obrazów w całym polu widzenia. Oferujemy również obiektyw mikroskopu achromatycznego, niedrogą opcję dla laboratoriów edukacyjnych i małych zespołów badawczych, które nie potrzebują najwyższej NA, oraz obiektyw achromatyczny 195, kompaktową suchą soczewkę idealną do kompaktowych systemów mikroskopowych stosowanych w pracy w terenie lub w diagnostyce przyłóżkowej.
Z kolei obiektywy immersyjne glicerolowe są wyposażone w pierścienie uszczelniające i specjalistyczne powłoki soczewek przystosowane do pracy z tą cieczą. Należy zanurzyć soczewkę: na próbkę nanieść niewielką kroplę gliceryny, opuścić obiektyw aż dotknie kropli i upewnić się, że pomiędzy soczewką a płynem nie znajdują się pęcherzyki powietrza (pęcherzyki powietrza rozpraszają światło i pogarszają jakość obrazu). Po użyciu należy dokładnie oczyścić soczewkę z gliceryny – glicerol jest lepki, więc pozostawiony do wyschnięcia może pozostawić osad, który z czasem wpłynie na działanie soczewek. Ten dodatkowy krok oznacza, że cele polegające na zanurzeniu w glicerynie są mniej odpowiednie w przypadku procesów o dużej przepustowości, takich jak przemysłowa kontrola jakości, gdzie należy sprawdzić dziesiątki próbek w krótkich odstępach czasu. Nie są również kompatybilne z próbkami, które nie nadają się do zanurzenia w cieczy: jeśli próbka jest mokra lub pracujesz z żywymi komórkami, które mogłyby zostać uszkodzone przez glicerol, jedynym realnym wyborem jest suchy obiektyw.
Kolejną kluczową różnicą jest odległość robocza. Odległość robocza to przestrzeń pomiędzy dolną częścią obiektywu a powierzchnią próbki, gdy soczewka jest ustawiona w ostrość. Obiektywy suche, szczególnie te o dużej mocy, mają zwykle dłuższe odległości robocze. Obiektyw o powiększeniu 100x może mieć odległość roboczą kilku milimetrów, co daje przestrzeń do manipulowania próbkami, dodawania plam lub używania szkiełek nakrywkowych bez ryzyka uderzenia soczewki w próbkę. Jednakże obiektywy o dużej mocy zanurzane w glicerynie mają znacznie krótsze odległości robocze – często mniejsze niż milimetr w przypadku soczewek 100x. Dzieje się tak dlatego, że mostek glicerynowy pozwala soczewce zbliżyć się do próbki, aby uchwycić więcej światła, ale oznacza to, że należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uderzenia próbki, co może spowodować uszkodzenie zarówno soczewki, jak i preparatu. W przypadku zadań, w których trzeba często zmieniać położenie próbek lub pracować z nierównymi próbkami, dużą zaletą jest większa odległość robocza od suchego obiektywu.
Kontrast to kolejny obszar, w którym oba typy się różnią, szczególnie w połączeniu ze specjalistycznymi technikami obrazowania. Obiektywy suche dobrze sprawdzają się w jasnym polu, kontraście fazowym, a nawet podstawowej fluorescencji, ale w zastosowaniach o wysokim kontraście, takich jak kontrast różnicowo-interferencyjny (DIC) lub mikroskopia w ciemnym polu, zanurzenie w glicerynie może poprawić wychwytywanie światła. Właśnie dlatego oferujemy obiektyw Infinity Plan High Contrast Objective, suchą soczewkę zoptymalizowaną pod kątem obrazowania o wysokim kontraście przezroczystych próbek, takich jak niezabarwione komórki, ale oferujemy również alternatywy oparte na glicerynie, zapewniające jeszcze ostrzejszy kontrast w obrazowaniu w super rozdzielczości lub obrazowaniu konfokalnym. Czekaj, właściwie techniki superrozdzielczości, takie jak STED (wyczerpywanie emisji wymuszonej), w dużym stopniu opierają się na dużej zawartości NA, więc w tych zastosowaniach często wybierane są obiektywy z zanurzeniem w glicerynie, ponieważ suche obiektywy po prostu nie są w stanie osiągnąć NA wymaganego do rozdzielenia struktur poniżej 200 nanometrów.
Rozprawmy się także z powszechnymi błędnymi przekonaniami: niektórzy użytkownicy uważają, że wszystkie obiektywy immersyjne są przeznaczone wyłącznie dla obiektywów o powiększeniu 100x, ale to nieprawda. Istnieją obiektywy z 20- i 40-krotnym zanurzeniem w glicerynie do prac ze średnią mocą, które nadal zapewniają wyższą zawartość NA niż ich suche odpowiedniki. I nie wszystkie ciecze to glicerol, ale glicerol jest najpowszechniejszy, ponieważ jest nietoksyczny, ma współczynnik załamania światła zbliżony do szkła i jest stosunkowo stabilny. Inną opcją jest olejek immersyjny, ale olej jest kompatybilny tylko ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, podczas gdy glicerol działa zarówno ze szkiełkami nakrywkowymi szklanymi, jak i plastikowymi, co jest dużym plusem w przypadku wielu nowoczesnych próbek laboratoryjnych.
Koszt jest również czynnikiem praktycznym. Obiektywy suche są na ogół tańsze niż ich odpowiedniki immersyjne w glicerynie, szczególnie w przypadku soczewek dla początkujących. Cena naszego obiektywu achromatycznego 185 jest dostosowana do napiętych budżetów laboratorium, dzięki czemu idealnie nadaje się do zastosowań edukacyjnych, w których uczniowie uczą się podstaw mikroskopii. Jeśli jednak potrzebujesz dodatkowej rozdzielczości do zaawansowanych badań, warto zainwestować w obiektywy zanurzeniowe w glicerynie. Kompromisem jest niższa przepustowość i ostrożniejsza obsługa, ale poprawa jakości obrazu może mieć ogromne znaczenie dla Twojej pracy.
Kiedy więc wybrać który? Jeśli przeprowadzasz rutynowe obserwacje, laboratoria edukacyjne, inspekcje o dużej przepustowości lub pracujesz z żywymi próbkami lub nierównymi powierzchniami, suchy obiektyw z naszego katalogu, taki jak obiektyw achromatyczny 195, idealny do zastosowań ogólnych, spełni Twoje potrzeby. Jeśli patrzysz na maleńkie struktury subkomórkowe, cienkie warstwy półprzewodników lub potrzebujesz maksymalnej rozdzielczości w pracach naukowych, lepszym wyborem będzie obiektyw zanurzeniowy w glicerynie, o ile jesteś przygotowany na ostrożne obchodzenie się z cieczą.
Ostatecznie różnica między obiektywami suchymi a obiektywami zanurzeniowymi w glicerynie to nie tylko szczegół techniczny – to wybór, który wpływa na jakość Twojej pracy. Jako dostawca widziałem, jak zespoły marnowały czas i zasoby, wybierając niewłaściwy obiektyw, dlatego zawsze zachęcam klientów, aby najpierw przemyśleli swój przypadek użycia: jaka jest wielkość próbki? Jakiej rozdzielczości potrzebujesz? Czy Twoja próbka jest w stanie wytrzymać zanurzenie w cieczy? Jeśli chcesz znaleźć właściwy cel dla swoich projektów, skontaktuj się z naszym zespołem, aby omówić Twoje konkretne potrzeby. Pomożemy Ci porównać całą naszą ofertę, od podstawowego obiektywu mikroskopu achromatycznego po specjalistyczne obiektywy o wysokim kontraście i obiektywy planistyczne, aby znaleźć idealne dopasowanie.
Referencje
- Inoué, S. i Spring, KR (1997). Mikroskopia wideo: podstawy. Prasa Plenum.
- Murphy, DB (2001). Podstawy mikroskopii świetlnej i obrazowania elektronicznego. Wiley-Liss.
- Abramowitz, M. i Stegun, IA (red.). (1972). Podręcznik funkcji matematycznych ze wzorami, wykresami i tabelami matematycznymi . Publikacje Dovera.
- Lang, W. (2007). Mikroskopia optyczna: zasady i zastosowania . Prasa CRC.